1 总述实时荧光定量PCR（后续简称为qPCR）顾名思义就是在PCR反应体系中加入荧光物质，通过荧光信号的实时接收监测PCR反应进程，由于其模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，以此为依据进而达到定量的目的。简单来讲，qPCR可分为荧光染料法（以SYBR GreenⅠ最常用）与荧光探针法（TaqMan 探针）两种，而其结果分析方法也有绝对定量和相对定量之分。在此不一一赘述，此次分享以SYBR GreenⅠ法为例，结果分析选用相对定量法。 2 实验设计2.1 总

蓝白斑筛选中，阳性克隆应该是蓝色还是白色？ 蓝色 白色 阳性克隆菌落，应该是白色的。 蓝白斑筛选中菌落会变蓝色，是因为β-半乳糖苷酶将培养基中的X-gal转变为蓝色可溶性物质。 β-半乳糖苷酶怎么来的呢？一部分来自载体具有lacZ基因，一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码α肽链的基因。一部分来自缺陷型大肠杆菌的编码β半乳糖苷酶的C端基因。当二者产物组合在一起，就具有活性β-半乳糖苷酶的产生，此现象称为α-互补。 而阳性克隆中

以下是免疫组化实验的详细步骤及常用到的产品： 步骤： 1. 切片准备：将组织进行石蜡包埋，切成薄片并贴附于载玻片上。 - 用到的产品：载玻片等。 2. 烤片：将切片放入烤箱中适当温度烤片，使切片紧密贴附。 3. 脱蜡：依次使用二甲苯等进行脱蜡处理。 - 用到的产品：二甲苯、乙醇等。 4. 水化：梯度乙醇水化至水。 5. 抗原修复：根据需要选择合适的抗原修复方法，如热修复或酶修复等。 - 用到的产品：抗原修复液等。 6. 灭活内源性过氧化物酶

免疫荧光实验原理很简单，其实就是使用荧光二抗，并在荧光显微镜下采集图像，其它的和IHC或ICC区别不大。 但是，想要得到良好的结果却很难，大家经常会遇以下问题： （1）目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果； （2）蛋白荧光太强，甚至形成非特异性的标记，一些背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果； （3）DAPI染细胞核时，加入的试剂太多，造成高背景染色； （4）组织切片预处理不当或采用石蜡切片，

1 总述实时荧光定量PCR（后续简称为qPCR）顾名思义就是在PCR反应体系中加入荧光物质，通过荧光信号的实时接收监测PCR反应进程，由于其模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，以此为依据进而达到定量的目的。简单来讲，qPCR可分为荧光染料法（以SYBR GreenⅠ最常用）与荧光探针法（TaqMan 探针）两种，而其结果分析方法也有绝对定量和相对定量之分。在此不一一赘述，此次分享以SYBR GreenⅠ法为例，结果分析选用相对定量法。 2 实验设计2.1 总

培养基既是供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和增殖的环境，所以非常重要。细胞培养液是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。根据其成分、用途和性质，培养基可以分为以下几类：合成培养基：合成培养基的成分明确，营养全面，适用于各种细胞类型的培养。常见的合成培养基有MEM、DMEM、RPMI等。天然培养基：天然培养基以动物血清或血浆为基质，

蛋白质含量可从它们的物理化学性质，如折射率、比重，紫外吸收、染色等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、 folin-酚试剂反应、BCA法等方法来测定。 一、比色法 蛋白定量常使用的方法是比色法，通常用于总蛋白的定量分析。根据蛋白和比色试剂的结合，可以将比色法分为：蛋白-染料结合法和蛋白-铜螯合化学试剂法。前者对应的典型蛋白定量比色法是考马斯亮蓝G250染料结合法，后者则包括双缩脲法，Lowry法，二喹啉甲酸(BCA)法。 1、

培养基既是供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和增殖的环境，所以非常重要。细胞培养液是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。根据其成分、用途和性质，培养基可以分为以下几类：合成培养基：合成培养基的成分明确，营养全面，适用于各种细胞类型的培养。常见的合成培养基有MEM、DMEM、RPMI等。天然培养基：天然培养基以动物血清或血浆为基质，

加药细胞换液的步骤如下：1 换液时间：一般建议每24或者48小时换液一次。2 准备新的培养基：根据细胞类型和生长需求，选择合适的培养基。确保培养基新鲜、无菌，并在使用前预热至37℃。收集旧培养基：轻轻摇晃培养瓶，使旧培养基充分混合。使用移液器将旧培养基收集到废液缸。注意不要触碰到细胞表面。3 添加新培养基：将收集到的旧培养基丢弃，向培养瓶中加入新的培养基。确保新的培养基充分覆盖细胞表面，避免气泡产生，也可以部分换

蛋白表达和RNA水平不一致的原因有： 转录后调控：mRNA在转录后可以经历多种调控过程，如剪接、编辑、降解和稳定性调控。这些过程可以影响mRNA的稳定性和翻译效率。 miRNA的作用：miRNA是一类小分子RNA，它们可以与mRNA的3'非翻译区（3'UTR）结合，导致mRNA降解或抑制其翻译成蛋白质，从而降低蛋白质的表达水平。 蛋白质稳定性：蛋白质的稳定性受多种因素影响，包括蛋白质的降解速率、糖基化修饰、磷酸化等翻译后修饰。如果蛋白质的稳定性降

在液相色谱分析过程中，常会出现下面9种色谱峰，你知道每种色谱峰产生的原因和解决办法吗？ 01、峰拖尾峰拖尾原因总结如下： 1、柱筛板堵塞：色谱柱的进出口的筛板堵塞，样品进入色谱柱时会受阻，液体流动受阻形成延迟，使得样品在相中停留时间变长，从而使峰型拖尾。 阻塞原因：A、配置流动相时污染 B、型号规格插口不匹配，在扭紧的那时候造成形变而促使管道阻塞。 C、试品解决液清洁得不整洁，长期性会在六通阀和柱中间产生堵塞受阻

WB实验中，PVDF膜如何选择？怎样活化？转膜后怎么保存？等等操作，小伙伴都清楚不？今天跟小编一起了解下吧。 选膜：选择合适的膜是关键之一。不同的膜具有不同的特点，需要根据实验的具体需求进行选择。转移分子量小于20kDa的蛋白时建议使用小孔径的膜 (如0.22μm)，正常情况下使用0.45μm孔径的膜即可。PVDF膜浸泡步骤？湿转： (1) 将膜在甲醇中浸泡30秒。膜应均匀的从不透明变成半透明。(2) 小心的将膜放入双蒸水中，浸泡2分钟。(3) 小心的将膜

今天给小伙伴们分享的是PCR引物设计的8大原则，直接上干货，设计引物的时候，我们都需要考虑哪些因素呢？ PCR引物设计的目的是确保PCR反应能够有效、特异性地扩增目标DNA序列。所以引物的好坏，直接关乎实验的成功。1 引物长度：18-30nt，通常以20nt左右最为常用。上下游引物的长度最好基本相等，最多相差不超过3bp。引物过短，易导致非特异扩增；较长的引物虽特异性好，但在引物内易形成二级结构，如发夹环。2 引物GC含量：40-60%，G+C比例太低

在组织学中，石蜡切片和冰冻切片都是常用的方法，前者常用于进行免疫组化实验，后者则常用于免疫荧光实验。 组织学常规制片技术中最为广泛应用的切片方法，为石蜡切片与冷冻切片。石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤，为永久性显微玻片标本。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化

为了排除某些因素对PCR结果的影响，PCR实验需要对照实验。PCR的阳性对照是Marker，推测PCR产物长度，判断PCR产物是否是目的片段。PCR的阴性对照是PCR的空白管，除了模板不加之外，其成分与其他管一样，证明没有其他模板污染。由于目前所用的PCR仪器自动化程度较低，操作步骤较为繁杂，人为因素大，这就不可避免地会出现不同程度的误差。轻微的污染、加量的误差等均可导致结果较大的差异，甚至阳性和阴性出现两种迥然不同的结果。在分析测定工

在细胞培养的过程中支原体污染是一个让人头疼的问题。它如同一个“不速之客”，悄然潜入细胞培养体系，给我们的实验带来诸多困扰。你是否有过这样的经历，培养的细胞无声无息地就被毁掉了？实验数据很难重复？ 那么，当我们遭遇支原体污染时，该如何应对呢？今天，让我们一起来探讨这个困扰。 支原体是一种直径大小仅为0.1-0.3μm，无细胞壁，可轻松透过一般过滤膜混入培养系统中的最小最简单的原核生物，呈高度多形性，有球形、杆形、

质粒提取主要包括三个步骤：菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA，和质粒DNA的分离与纯化。质粒提取主要有碱裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。 质粒提取方法中，最常用的是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特色。碱裂解法是根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。其原理是：在强碱环境（pH12.0-12.6）下，细菌的细胞壁和细胞膜被SDS破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，宿主细胞的蛋白质、染色体及线性DNA

一、线粒体基础知识 1、什么是线粒体？ 线粒体是一种双膜结构的细胞器，分布在几乎所有真核细胞中。它们负责将营养物质转化为化学能量（ATP），供细胞使用。 2、为什么说它是“半自主性”的？ 线粒体拥有自己的DNA和遗传体系，但与细菌类似，它们的基因组有限。除了某些特定的基因，大部分线粒体的蛋白质由细胞核DNA编码，在细胞质中合成后运输到线粒体内。 3、线粒体有哪些功能？ 除了能量转换，线粒体还参与细胞分化、信号转导、细胞周

由于不良的饮食和生活习惯，导致现代不少人成为了血栓性疾病的高风险人群。目前我国血栓性疾病领域呈现出高发病、高死亡、高致残、高复发这“四高”特征，患者总人数已达千万以上。 究竟什么是血栓性疾病？日常预防要注意哪些？现代医学是否有先进的干预措施呢？今天一文带你了解清楚。 沉默的杀手”：血栓性疾病 什么是血栓？ 通俗来讲，血栓就是血管中的「血块」堵住了身体各个器官血管通道。在正常生理状态下，人体通过自身的凝

4月24日，我们迎来了“世界实验动物日”，一个值得所有人静心思考、深刻铭记的时刻。在这个时刻，我们不仅缅怀那些为科学进步做出牺牲的实验动物，更要探讨如何更好地尊重生命，促进科学研究与伦理道德的和谐共生。 它们是科学的探路者 实验动物，这些不会言语的生命，在科学的征途中扮演着不可或缺的角色。从基础医学研究到新药开发，从疫苗试验到疾病模型构建，它们为人类健康事业的进步贡献了不可估量的力量。每一项重大医学突破

大家好，今天聊下做的aPCR数据可以进行分析，能不能用这个问题，判断 qPCR 数据是否可用需要考虑以下几个方面： 扩增曲线：扩增曲线应该呈现出典型的 S 型曲线，且曲线应该平滑，没有明显的锯齿状或平台期。 阈值线：阈值(threshold)一般是基线的标准偏差的10倍。阈值线应该位于扩增曲线的指数增长期，且应该在曲线的中部，不应过高或过低。 CT 值：CT 值(循环阈值)是指扩增曲线达到阈值线所需的循环数。CT 值应该在合理的范围内，一般来说，CT

细胞培养时，血清是否需要热灭活取决于具体的实验需求和细胞类型。一般来说，热灭活血清有以下一些考虑因素： 去除潜在的污染物：热灭活可以破坏血清中的补体、支原体等潜在的有害物质，减少对细胞的影响。 减少免疫反应：血清中的某些成分可能引发免疫反应，热灭活可以降低这种可能性。 稳定性：热灭活后的血清在储存和使用过程中可能更稳定，不易发生变质。 然而，热灭活血清也可能带来一些不利影响： 损失活性物质：某些血清中的

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。 在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不

PCR反应中的主要由引物、 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、Mg2+、模板和Taq DNA聚合酶五个成份组成。各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。 1 引物 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则： （1） 引物长度约为16-30 bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。 （2）引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引

抗体是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。 1. 做流式的抗体和免疫组化的抗体是一样的吗? 不一定能通用。流式是用直接标记还是间接标记?如果是直接标记的话，那这个抗体一般不是FITC标记或者就是TRITC，PE之类的。如果恰好你的免疫组化，也是想用

分子克隆实验——无缝克隆 今天和大家讲讲无缝克隆常见的问题以及解决方法。 1.平板上很少或者没有克隆菌落 建议使用试剂盒附带的阳性对照，可排除试剂盒本身的影响。进一步判定，主要有以下可能的情况和建议： 01载体制备 线性化载体和插入片段的纯度不够，抑制反应。 02插入片段制备 1、引物设计不正确：同源臂15~25nt（不计算酶切位点）,CG含量40~60%。 2、线性化载体和插入片段的纯度不够，抑制反应。若线性化载体与插入片段已经过纯化，

菌种活化就是将保藏状态的菌种 放入适宜的培养基中培养 逐级扩大培养得到纯而壮的培养物 即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物 菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化，让菌种逐渐适应培养环境。 01、一般菌种临时存放及活化 1.低温保存管应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2.准备 37℃之 70﹪酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代

1增强剂 1. 激活剂：激活剂通过改善聚合酶的活性，让整个PCR过程焕发活力。10~100ug/ml BSA（牛血清白蛋白）就能在某些情况下提升聚合酶的稳定性和活性。 2. 保护剂：保护剂的作用在于防止模板DNA降解，确保DNA的完整性。如T4基因32蛋白能保护单链DNA不受核酸酶攻击。 3. 增效剂：增效剂能够提高引物与模板间的亲和力，从而提升扩增的特异性。1%~10%DMSO（二甲基亚砜）就是一种常用的增效剂，能使PCR反应在较高温度下进行，有助于解决模板二级结构引起