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0000000qPCR实验中通常会遇到复孔间重复性差的情况,一般有以下两种: 一、CT值很大,如CT≥30,重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布,即在有效模板量很少的情况下,模板与引物的碰撞存在随机性,直接导致复孔间的CT值差异较大。解决方法为如果融解曲线没有杂峰,无模板阴性对照同目的基因的△CT值为3 or 5以上,那CT值为准确的,可多设置几个复孔,选择重复性好的CT值参与计算。 二、CT<30,重复性较差。这种情况一般同操作有关。可从以下几0实验室有用于培养细胞的超净台,内置酒精灯一个。老师传授授说在打开培养瓶或培养液之前要用酒精灯的火焰快速的烧一下,目的是消毒,减少污染。自己很怀疑这样做的有效程度,因为瞬间的火焰不可能将瓶口的温度升高很多,又如何达到消毒的目的呢?在网上搜索后找到一些资料,认为不应在超净台内使用火焰。那么超净台和安全柜内到底应不应该有酒精灯。 超净台正方观点: 支持方理由如下:无菌是分等级的,超净工作台一般可以达到局部001. 上样:样品加载: 上样量:细胞:10ug,组织:20ug,标记物上样量:2ul。 2. 电泳:分离胶浓度:常见有10%、9%和6%(大分子量选用浓度较低的胶,小分子量则相反)。浓缩胶浓度:5%。 电泳缓冲液配制:将100ml母液加入900ml蒸馏水,再加入1g SDS。 电泳条件:运行浓缩胶条件为80v,40min;运行分离胶条件为120v,50min。 3. 转膜:电转液:100ml母液+700ml蒸馏水+200ml甲醇(1)将PVDF膜在100%甲醇中浸泡10秒至15秒。 (2)倒入配置好的转印缓冲液于平底托盘中,将0011. 蛋白类型 确定你的蛋白是什么类型,蛋白类型决定你要使用的表达系统。 胞质蛋白——大肠杆菌系统 分泌蛋白——酵母表达系统(因为大肠杆菌系统缺乏翻译后修饰功能) 膜蛋白——杆状病毒或酵母表达系统 2. 酶切位点 分析目的蛋白DNA序列的酶切位点,使用T4连接酶的方式构建载体时,不要使用目的蛋白DNA序列包含的酶切位点,以防将目的蛋白的DNA序列切断。 3. 稀有密码子 定义:遗传密码子有64种,但是绝大多数生物使用密码子具有偏好性,倾0000000000000000000如何选择最合适的抗体稀释液,以确保我们的WB实验结果既清晰又准确?我们可以分析几种具体的抗体稀释液,以及它们如何帮助解决抗体稀释的问题:1 通用型抗体稀释液:这种稀释液适用于多种免疫检测实验(如IF、IHC、ELISA、WB)。它含有抗体结合反应增强剂和稳定剂,可以增加抗体的溶解度和稳定性,提高实验的特异性和灵敏度。例如,Genefist GF1600-1通用型抗体稀释液,可以在4°C保存和使用不少于六个月。2 脱脂奶粉:这是一种传统选择,优点是0蓝白斑筛选中,阳性克隆应该是蓝色还是白色? 蓝色 白色 阳性克隆菌落,应该是白色的。 蓝白斑筛选中菌落会变蓝色,是因为β-半乳糖苷酶将培养基中的X-gal转变为蓝色可溶性物质。 β-半乳糖苷酶怎么来的呢?一部分来自载体具有lacZ基因,一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码α肽链的基因。一部分来自缺陷型大肠杆菌的编码β半乳糖苷酶的C端基因。当二者产物组合在一起,就具有活性β-半乳糖苷酶的产生,此现象称为α-互补。 而阳性克隆中0免疫荧光实验原理很简单,其实就是使用荧光二抗,并在荧光显微镜下采集图像,其它的和IHC或ICC区别不大。 但是,想要得到良好的结果却很难,大家经常会遇以下问题: (1)目标蛋白的荧光很弱,导致组间差异并不明显,造成假阴性结果; (2)蛋白荧光太强,甚至形成非特异性的标记,一些背景染色可能被误认为阳性区域,造成假阳性结果; (3)DAPI染细胞核时,加入的试剂太多,造成高背景染色; (4)组织切片预处理不当或采用石蜡切片,0一、原理 蛋白质免疫印迹法即Western Blot。 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜(NC膜)或PVDF膜上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显00在细胞培养的过程中支原体污染是一个让人头疼的问题。它如同一个“不速之客”,悄然潜入细胞培养体系,给我们的实验带来诸多困扰。你是否有过这样的经历,培养的细胞无声无息地就被毁掉了?实验数据很难重复? 那么,当我们遭遇支原体污染时,该如何应对呢? 今天,让我们一起来探讨这个困扰。 支原体是一种直径大小仅为0.1-0.3μm,无细胞壁,可轻松透过一般过滤膜混入培养系统中的最小最简单的原核生物,呈高度多形性,有球形、杆形0在大多数的WB实验步骤中,电泳和湿转条件都是经验性的,因为实验试剂的厂家、浓度及实验室习惯等条件影响,网络上诸多经验性的实验方法可能并不适用于所有实验室或者实验人员;尤其是新的课题组或者新手实验人员。可以进行预实验,确定实验步骤的所有时间条件,而预实验中实验条件的确定依赖两种常用的染色方法,即考马斯亮蓝染色(coomassie brilliant blue staining)和丽春红染色(Ponceau S staining)。此外,上述两种染色还能帮助实验纠错,有0qPCR实验中通常会遇到复孔间重复性差的情况,一般有以下两种: 一、CT值很大,如CT≥30,重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布,即在有效模板量很少的情况下,模板与引物的碰撞存在随机性,直接导致复孔间的CT值差异较大。解决方法为如果融解曲线没有杂峰,无模板阴性对照同目的基因的△CT值为3 or 5以上,那CT值为准确的,可多设置几个复孔,选择重复性好的CT值参与计算。 二、CT<30,重复性较差。这种情况一般同操作有关。可从以下几0qRT-PCR(定量逆转录聚合酶链反应)和Western blot(蛋白质印迹法)是两种常用的生物分子检测技术,它们分别用于检测mRNA和蛋白质的表达水平。虽然蛋白质是由mRNA翻译而来,但mRNA的表达水平总是与蛋白质的表达水平一致吗?做实验任何一个结果如果你验证了几遍都是一样,那么请不要怀疑自己,也许不是你做错了,试图去解释这种现象! 蛋白表达和RNA水平不一致的原因有: 转录后调控:mRNA在转录后可以经历多种调控过程,如剪接、编辑、降解和稳定01 如何解决? 均匀悬浮细胞:在进行细胞铺板前,确保细胞悬浮均匀。可以通过轻轻振荡或轻轻旋转培养皿来均匀悬浮细胞,避免细胞聚集或沉积。 使用适当的细胞密度:根据实验的需要,选择适当的细胞密度进行铺板。过高或过低的细胞密度都可能导致不均匀的细胞铺板。可以根据经验或文献中的建议,选择适当的细胞密度;也可以事先预实验摸索,通过接种不同密度的细胞,观察或监测其生长情况来确认合适的接种密度。 均匀分布培养基:在细0qPCR实验中通常会遇到复孔间重复性差的情况,一般有以下两种: 一、CT值很大,如CT≥30,重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布,即在有效模板量很少的情况下,模板与引物的碰撞存在随机性,直接导致复孔间的CT值差异较大。解决方法为如果融解曲线没有杂峰,无模板阴性对照同目的基因的△CT值为3 or 5以上,那CT值为准确的,可多设置几个复孔,选择重复性好的CT值参与计算。 二、CT<30,重复性较差。这种情况一般同操作有关。可从以下几000