大家好，今天给大家解读一篇题为”Functional patient-derived organoid screening sidentify MCLA-158 as a thera peutic EGFR X LGR5bis pecific antibody with efficacy in epit helial tumors ”使用来自癌症患者的类器官库对500多个双特异性抗体进行筛选，从中发现了名为 MCLA-158 的 EGFR × LGR5 双特性抗体，能够有效抑制结直肠癌类器官的生长，并抑制癌症转移，相关研究成果于2022年4月发表在Nature杂志上。
01
研究背景
患者来源的类器官 （PDO） 概括了肿瘤结构，包含癌症干细胞，并具有支持个性化医疗的预测价值。在这里，我们描述了异质性结直肠癌PDO生物库和配对的健康结肠粘膜样本上的双靶向双特异性抗体（bAb）的大规模功能筛选。通过高内涵成像对针对 Wingless 相关整合位点 （WNT） 和受体酪氨酸激酶 （RTK） 靶标产生的 500 多个治疗性 bAb 进行功能评估，以捕捉 PDO 反应的复杂性。
见图一
PDO的基因组改变。
图一
a. PDO生物样本库和TCGA CRC数据集中常见驱动基因突变的频率9。
b.图表显示生物库中跨染色体区域杂合性片段扩增，缺失和缺失的PDO百分比。图表的上半部分对应于PDO生物样本库，下半部分对应于TCGA CRC数据集9。
c. 每个 PDO 中的单碱基替换数。
d.每个PDO中的小插入缺失数。
e. 突变特征的频率25在每个 PDO 中。
见图二
MCLA-158 的分子表征。
图二
a.图中所示的实验中培养的无EGF或EGF（5ng / mL）培养的KRAS突变PDO的示例。1d.使用Hoechst用蓝色标记DNA，使用鬼笔环肽用红色标记肌动蛋白。这些照片是从第 7 天培养物中拍摄的。比例尺为 200 μm。
b.图中实验中培养的无EGF或EGF（5ng / mL）培养的KRAS野生型PDO的示例。1e. 比例尺为 200 μm。
c.MCLA-158在EGFR上的丙氨酸扫描表位定位。对于每个克隆，与Ab MCLA-158的平均结合值绘制为克隆的平均EGFR表达值（灰色圆圈）的函数。有助于MCLA-158与EGFR结合的关键残基用蓝色表示。
d. MCLA-158 在 LGR5 上的丙氨酸扫描表位定位。对于每个克隆，将 Ab MCLA-158 的平均结合值绘制为克隆的平均 LGR5 表达值（灰色圆圈）的函数。有助于 MCLA-158 与 LGR5 结合的关键残基以蓝色表示。
e.用Fab072二价抗体或对照TT抗体染色的代表性P18T PDO的流式细胞术直方图。指示用于分离Fab072+和Fab072-细胞以进行后续实验的门。
f.通过RT-qPCR对FACS纯化的细胞群进行LGR5 mRNA水平。一个代表性 PDO +/- SD. g. 的 n=3 个技术重复的平均值。使用 Fab072 或 Fab266（无关 TT 对照）抗体对 PDO 生物样本库样品进行流式细胞术分析。显示了平均荧光强度 （MFI） 值。
见图三
MCLA-158 对 PDO 的影响。
图三
a.代表性Ki67 IHC染色的定量结果如图所示。4b. 下面板是放大倍数。上面板的棒为 10 μm，下面板的棒为 30 μm。
b.用浓度为2μgml的指示抗体处理的P18T PDO的代表性细胞周期图-1.表示每个细胞周期阶段的细胞百分比。
c.用指定抗体处理的PDO P18T培养物中的细胞核大小。每个点表示独立切片中所有类器官的平均细胞核面积（像素）（西妥昔单抗 n=2，MCLA-158 n=7，EGFRxTT 为 4，TTxTT 为 5）。线标记均值。线性模型的双尾Wald检验。
d. 用指示的抗体以 20 μg ml 的浓度处理 P18T 培养物 4 天-1然后抗体被洗掉（箭头）。监测类器官大小，y 轴显示相对于治疗开始之日的增长。每个数据点均为平均值 +/- 标准误差（n=3 个独立孔）。双尾非配对 t 检验。
e.通过流式细胞术分析亲本未感染，shControl和shLGR5 P18T PDO培养物中的MCLA-158 +细胞分布。作为阴性对照，我们用TT-TT抗体染色，将细胞频率归一化为每个样品的模式。
见图四
MCLA-158 在 PDX 和原位异种移植物中的作用。
图四
a.Kaplan-Meier图显示小鼠存活的实验如图所示。4j. 使用 Log-rank Mantel-Cox 检验 MCLA-158 和西妥昔单抗之间的长秩 P 值。
b.实验中单个P18T异种移植物的体积如图所示。
C. 携带 PDO C31M 来源的皮下异种移植物的小鼠用指示抗体或 PBS 处理。显示了相对于治疗第 1 天的肿瘤体积。每个数据点是肿瘤体积的平均值 +/- SEM。CET n=21 个肿瘤;MCLA-158 为 n=21，车辆在 day=0 时为 n=17。双尾非配对 t 检验。
d-f。实验的器官特异性转移如图所示。5J，K.g. 通过 RNAscope 在组织切片中对 M005 模型中发现的腹膜转移进行分析的 LGR5 mRNA（密度）。
见图五
与图中实验相对应的皮下CRC PDX生长。
图五
面板显示单个小鼠的生长。采用双尾非配对t检验计算p值。
见图六
MCLA-158 在正常结肠粘膜和 CRC 衍生类器官中的定位。
图六
a.用MCLA-158或EGFR（Fab232）或LGR5（Fab072）与对照TT臂处理的P18T和C0M PDO的代表性共聚焦图像。PDO治疗24小时。通过免疫荧光检测抗体定位。箭头表示抗体（绿色）位于基底外侧膜。箭头表示抗体在细胞质中的定位。红色染色是用鬼笔环肽标记的肌动蛋白。细胞核（蓝色）用Hoechst染色。比例尺为 50 μm。
b.用MCLA-158治疗24小时的正常结肠粘膜（C82N和C110N）和CRC（C55T和C47T）PDO的代表性共聚焦图像。加入抗体的浓度为1μg ml-1.免疫荧光法检测MCLA-158（红色）和EGFR（绿色）定位。箭头表示MCLA-158在基底外侧膜的定位。箭头表示 MCLA-158 在细胞质细胞内结构中的定位。比例尺为 100 μm。
c.毛细血管蛋白质印迹的虚拟图像，测量P18T，C55T或C82N（正常粘膜PDO）蛋白提取物上的EGFR水平。以 1 μg ml 的浓度加入抗体-1对于指定的时间点。
02
研究结论
我们的药物发现策略导致了 MCLA-158 的产生，MCLA-158 是一种 bAb，可在富含亮氨酸重复序列的含 G 蛋白偶联受体 5 阳性 （LGR5+） 癌症干细胞中特异性触发表皮生长因子受体降解，但对健康的 LGR5+ 结肠干细胞显示出最小的毒性。MCLA-158在几种上皮癌类型的临床前模型中表现出治疗特性，例如抑制KRAS突变结直肠癌的生长、阻断转移的起始和抑制肿瘤的生长。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
患者来源的类器官 （PDO） 概括了肿瘤结构，包含癌症干细胞，并具有支持个性化医疗的预测价值。在这里，我们描述了异质性结直肠癌PDO生物库和配对的健康结肠粘膜样本上的双靶向双特异性抗体（bAb）的大规模功能筛选。通过高内涵成像对针对 Wingless 相关整合位点 （WNT） 和受体酪氨酸激酶 （RTK） 靶标产生的 500 多个治疗性 bAb 进行功能评估，以捕捉 PDO 反应的复杂性。
见图一
PDO的基因组改变。
图一
a. PDO生物样本库和TCGA CRC数据集中常见驱动基因突变的频率9。
b.图表显示生物库中跨染色体区域杂合性片段扩增，缺失和缺失的PDO百分比。图表的上半部分对应于PDO生物样本库，下半部分对应于TCGA CRC数据集9。
c. 每个 PDO 中的单碱基替换数。
d.每个PDO中的小插入缺失数。
e. 突变特征的频率25在每个 PDO 中。
见图二
MCLA-158 的分子表征。
图二
a.图中所示的实验中培养的无EGF或EGF（5ng / mL）培养的KRAS突变PDO的示例。1d.使用Hoechst用蓝色标记DNA，使用鬼笔环肽用红色标记肌动蛋白。这些照片是从第 7 天培养物中拍摄的。比例尺为 200 μm。
b.图中实验中培养的无EGF或EGF（5ng / mL）培养的KRAS野生型PDO的示例。1e. 比例尺为 200 μm。
c.MCLA-158在EGFR上的丙氨酸扫描表位定位。对于每个克隆，与Ab MCLA-158的平均结合值绘制为克隆的平均EGFR表达值（灰色圆圈）的函数。有助于MCLA-158与EGFR结合的关键残基用蓝色表示。
d. MCLA-158 在 LGR5 上的丙氨酸扫描表位定位。对于每个克隆，将 Ab MCLA-158 的平均结合值绘制为克隆的平均 LGR5 表达值（灰色圆圈）的函数。有助于 MCLA-158 与 LGR5 结合的关键残基以蓝色表示。
e.用Fab072二价抗体或对照TT抗体染色的代表性P18T PDO的流式细胞术直方图。指示用于分离Fab072+和Fab072-细胞以进行后续实验的门。
f.通过RT-qPCR对FACS纯化的细胞群进行LGR5 mRNA水平。一个代表性 PDO +/- SD. g. 的 n=3 个技术重复的平均值。使用 Fab072 或 Fab266（无关 TT 对照）抗体对 PDO 生物样本库样品进行流式细胞术分析。显示了平均荧光强度 （MFI） 值。
见图三
MCLA-158 对 PDO 的影响。
图三
a.代表性Ki67 IHC染色的定量结果如图所示。4b. 下面板是放大倍数。上面板的棒为 10 μm，下面板的棒为 30 μm。
b.用浓度为2μgml的指示抗体处理的P18T PDO的代表性细胞周期图-1.表示每个细胞周期阶段的细胞百分比。
c.用指定抗体处理的PDO P18T培养物中的细胞核大小。每个点表示独立切片中所有类器官的平均细胞核面积（像素）（西妥昔单抗 n=2，MCLA-158 n=7，EGFRxTT 为 4，TTxTT 为 5）。线标记均值。线性模型的双尾Wald检验。
d. 用指示的抗体以 20 μg ml 的浓度处理 P18T 培养物 4 天-1然后抗体被洗掉（箭头）。监测类器官大小，y 轴显示相对于治疗开始之日的增长。每个数据点均为平均值 +/- 标准误差（n=3 个独立孔）。双尾非配对 t 检验。
e.通过流式细胞术分析亲本未感染，shControl和shLGR5 P18T PDO培养物中的MCLA-158 +细胞分布。作为阴性对照，我们用TT-TT抗体染色，将细胞频率归一化为每个样品的模式。
见图四
MCLA-158 在 PDX 和原位异种移植物中的作用。
图四
a.Kaplan-Meier图显示小鼠存活的实验如图所示。4j. 使用 Log-rank Mantel-Cox 检验 MCLA-158 和西妥昔单抗之间的长秩 P 值。
b.实验中单个P18T异种移植物的体积如图所示。
C. 携带 PDO C31M 来源的皮下异种移植物的小鼠用指示抗体或 PBS 处理。显示了相对于治疗第 1 天的肿瘤体积。每个数据点是肿瘤体积的平均值 +/- SEM。CET n=21 个肿瘤;MCLA-158 为 n=21，车辆在 day=0 时为 n=17。双尾非配对 t 检验。
d-f。实验的器官特异性转移如图所示。5J，K.g. 通过 RNAscope 在组织切片中对 M005 模型中发现的腹膜转移进行分析的 LGR5 mRNA（密度）。
见图五
与图中实验相对应的皮下CRC PDX生长。
图五
面板显示单个小鼠的生长。采用双尾非配对t检验计算p值。
见图六
MCLA-158 在正常结肠粘膜和 CRC 衍生类器官中的定位。
图六
a.用MCLA-158或EGFR（Fab232）或LGR5（Fab072）与对照TT臂处理的P18T和C0M PDO的代表性共聚焦图像。PDO治疗24小时。通过免疫荧光检测抗体定位。箭头表示抗体（绿色）位于基底外侧膜。箭头表示抗体在细胞质中的定位。红色染色是用鬼笔环肽标记的肌动蛋白。细胞核（蓝色）用Hoechst染色。比例尺为 50 μm。
b.用MCLA-158治疗24小时的正常结肠粘膜（C82N和C110N）和CRC（C55T和C47T）PDO的代表性共聚焦图像。加入抗体的浓度为1μg ml-1.免疫荧光法检测MCLA-158（红色）和EGFR（绿色）定位。箭头表示MCLA-158在基底外侧膜的定位。箭头表示 MCLA-158 在细胞质细胞内结构中的定位。比例尺为 100 μm。
c.毛细血管蛋白质印迹的虚拟图像，测量P18T，C55T或C82N（正常粘膜PDO）蛋白提取物上的EGFR水平。以 1 μg ml 的浓度加入抗体-1对于指定的时间点。
02
研究结论
我们的药物发现策略导致了 MCLA-158 的产生，MCLA-158 是一种 bAb，可在富含亮氨酸重复序列的含 G 蛋白偶联受体 5 阳性 （LGR5+） 癌症干细胞中特异性触发表皮生长因子受体降解，但对健康的 LGR5+ 结肠干细胞显示出最小的毒性。MCLA-158在几种上皮癌类型的临床前模型中表现出治疗特性，例如抑制KRAS突变结直肠癌的生长、阻断转移的起始和抑制肿瘤的生长。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
