实验吧 关注:4,785贴子:46,624
  • 0回复贴,共1

干货 | 蛋白实验之——CO-IP实验怎么做?

只看楼主收藏回复

利用抗体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白、复合体的一项技术,能够特异性富集所研究的目的蛋白的一种实验方法CO-IP(免疫共沉淀Co-inmunoprecipitation)更是我们主推服务之一。
实验原理
当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质A的抗体免疫沉淀A,那么与A在体内结合的蛋白质B也能沉淀下来。最终通过蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)进行检测。
实验流程;
1.培养实验所需细胞
2.外源性CO-IP需要转染外源质粒
3.细胞裂解(常用RIPA并添加PMSF等酶抑制剂)
4.免疫沉淀反应
①磁珠预处理(protein A/G或HA等标签磁珠)
②目标抗体与磁珠结合(一般抗体使用浓度为10-50ug/mL)
③抗原沉淀反应(含有抗体的磁珠与细胞裂解液结合)
④抗原洗脱(变性和非变性两种)
⑤WB检测及结果分析
实验注意事项:
1. 磁珠使用前应充分振荡均匀。
2. 选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。
3. 目的蛋白与互作蛋白不能表达量太低
4. 在合适的实验条件下操作,防止实验数据不稳定
5. 使用对照抗体:单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗;兔多克隆抗体:正常兔IgG
6. 细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质——蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的蛋白酶抑制剂PMSF。


IP属地:江西1楼2024-03-18 11:06回复