大家好，今天给大家分享一篇题为”Single-cell transcrip tomics for the assess ment of cardiac disease”（用于评估心脏病的单细胞转录组学）心脏样本包含比较丰富的细胞类型，其中的心肌细胞，神经元等细胞需通过抽核（Nucleus isolation）获得转录信息。
01
研究背景
心血管疾病是全球死亡的主要原因。需要对心血管疾病机制有深入的了解，以改善治疗策略和患者风险分层。最先进的大规模单细胞和单核转录组学促进了对心脏细胞景观的探索，超越了其描述性特征，并可以进一步了解疾病的机制并指导功能研究。
在这篇综述中，我们概述了单细胞和单核转录组学研究的实验设计中的技术挑战，并讨论了从这些研究得出的数据可以做出的推断类型。此外，我们还描述了从健康和疾病以及从发育到成年的每种主要心脏细胞类型的转录组学研究中得出的新发现。本综述还为解释新发现的心脏细胞类型和状态的详尽列表提供了指南，并强调了注释中的共识和不一致，表明迫切需要标准化。
我们描述了高级应用，例如将单细胞数据与空间转录组学集成，以绘制组织上的基因和细胞图谱，并定义调节体内平衡和疾病进展的细胞微环境。最后，我们讨论了新型转录组学方法的当前和未来的转化和临床意义，并展望了这些技术将如何改变我们诊断和治疗心脏病的方式。
见图一
单细胞和单核转录组学的工作流程。
图一
单细胞实验的设计和执行涉及一个需要仔细规划的多步骤过程。心肌细胞的评估具有挑战性，因为它们太大，无法使用荧光激活细胞分选 （FACS） 或大多数基于微流体的方法选择为单细胞。如果需要分析所有心脏细胞类型，则从冷冻样品中分离单个细胞核是目前最常用的方法，因为该技术允许以最高通量捕获所有已知的心细胞类型。细胞核分离需要酶解和机械解离，通常使用 Dounce 均质器来帮助释放细胞核。
在进行文库制备之前，可以通过过滤和FACS纯化细胞核，或者不太严格的方案包括过滤前的差速离心和密度梯度离心。如果只需要非心肌细胞，则新鲜样品的机械和酶组织解离可以恢复基质细胞和间质细胞。对于感兴趣的稀有细胞类型，可以通过细胞表面标记物的抗体标记，然后进行基于磁珠的富集或流式细胞术分选来实现特定群体的潜在富集。这些富集方法也可用于选择表达荧光蛋白的细胞，例如在谱系示踪实验中。
在分离和纯化步骤之后，捕获单细胞和细胞核，标记（通过条形码）并使用各种单细胞平台掺入文库制剂中：基于液滴的方法，例如10× Genomics的Chromium Controller，具有高通量;基于纳米孔的方法，例如：Takara Bio 的 ICELL8 仪器，它允许以中低通量选择各种细胞大小;微流体方法，如Fluidigm C1平台;基于多孔板的方案，如Smart-seq3xpress;以及基于多轮细胞分裂和池化的方法，例如 SPLiT-seq，它允许在不需要物理分离的情况下对单个细胞进行条形码编码。scRNA-seq，单细胞RNA测序;snRNA-seq，单核RNA测序。
见图二
计算分析工作流程。
图二
在对文库进行测序后，无论选择哪种采样程序，整个生物信息学流程基本相同。将读段与参考基因组比对后，使用全面的单细胞包（如 Scanpy 和 Seurat）进行质量控制、批次校正和数据集成。该过程中的一个关键步骤是细胞类型和状态的聚类和注释，这是在已知标记基因的表达和每个簇的转录特征的解释的基础上进行的。值得注意的是，基于深度学习的自动注释方法正在兴起。全面的注释有助于提高复杂下游分析的分辨率，例如：成分分析（在各种条件下组织中存在的各种细胞类型的比例）;不同疾病或治疗之间的差异表达分析;以及基于编码配体受体的基因在不同细胞类型和状态下的表达对细胞间通讯的推断。FC， 倍数变化;SMC，平滑肌细胞。
见图三
单细胞和单核分析揭示了成纤维细胞中以前未知的复杂性。
图三
成纤维细胞是体内平衡和疾病进展的关键，因为纤维化是对损伤反应的常见特征。单细胞和单核 RNA 测序为成纤维细胞在衰老心脏和不同疾病环境（如心肌梗死 （MI） 和扩张型心肌病 （DCM））中的作用提供了见解。使用单细胞和单核研究注释的成纤维细胞群列表如表2所示。COVID-19,2019 年冠状病毒病;TAC，横主动脉收缩。健康和患病心脏内皮细胞中基因标记物的物种特异性表达。
见图四
健康和患病心脏内皮细胞中基因标记物的物种特异性表达。
图四
a，人类心脏中主要血管结构的图示，包括心内膜，以及健康人类心脏中描述的关键内皮细胞亚群及其基因标记的总结。
b， 健康人和小鼠心脏内皮细胞中具有不同表达模式的基因。“无细胞状态特异性”表示该基因在多种细胞状态中富集，没有任何明确的特异性。
c， 在患病和健康心脏内皮细胞中差异表达的基因，包括扩张型心肌病（DCM）和缺血性心肌病（ICM）的人心脏，以及心肌梗死后（MI）后的小鼠心脏。TGFβ，转化生长因子-β。
见图五
将scRNA-seq和snRNA-seq数据与空间转录组学分析相结合，以定义细胞微环境及其动态细胞间信号网络。
图五
单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 和单核 RNA 测序 （snRNA-seq） 允许根据编码配体和受体的基因表达来定义细胞状态和预测细胞相互作用。但是，这些数据不提供有关蜂窝邻近性的信息。空间转录组学允许在代表微体转录组学数据的微瓦片上绘制组织切片内的基因表达图谱。通过使用 cell2location 和 Giotto 等计算工具将 scRNA-seq 和 snRNA-seq 数据映射到空间数据上，可以预测微瓦片和微解剖学生态位内细胞类型和状态的定位。定义的细胞生态位内的细胞接近性有助于推断最可能的细胞相互作用和鉴定的功能微环境。
02
研究结论
单细胞和单核组学技术为心脏细胞景观提供了宝贵的新见解，有助于更好地了解疾病机制，并为准确的风险分层和精准医疗提供更多工具。然而，新定义的细胞状态不仅需要彻底的验证，还需要合作和跨学科的努力，以标准化物种内和物种之间的定义和命名，这将有助于更准确的研究比较和疾病模型实验设计的优化。最后，迫切需要确保为新一代科学家和临床医生提供计算资源和培训，以改进对生物学的询问，并加速将这些变革性技术应用于心脏病的研究和治疗。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
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研究背景
心血管疾病是全球死亡的主要原因。需要对心血管疾病机制有深入的了解，以改善治疗策略和患者风险分层。最先进的大规模单细胞和单核转录组学促进了对心脏细胞景观的探索，超越了其描述性特征，并可以进一步了解疾病的机制并指导功能研究。
在这篇综述中，我们概述了单细胞和单核转录组学研究的实验设计中的技术挑战，并讨论了从这些研究得出的数据可以做出的推断类型。此外，我们还描述了从健康和疾病以及从发育到成年的每种主要心脏细胞类型的转录组学研究中得出的新发现。本综述还为解释新发现的心脏细胞类型和状态的详尽列表提供了指南，并强调了注释中的共识和不一致，表明迫切需要标准化。
我们描述了高级应用，例如将单细胞数据与空间转录组学集成，以绘制组织上的基因和细胞图谱，并定义调节体内平衡和疾病进展的细胞微环境。最后，我们讨论了新型转录组学方法的当前和未来的转化和临床意义，并展望了这些技术将如何改变我们诊断和治疗心脏病的方式。
见图一
单细胞和单核转录组学的工作流程。
图一
单细胞实验的设计和执行涉及一个需要仔细规划的多步骤过程。心肌细胞的评估具有挑战性，因为它们太大，无法使用荧光激活细胞分选 （FACS） 或大多数基于微流体的方法选择为单细胞。如果需要分析所有心脏细胞类型，则从冷冻样品中分离单个细胞核是目前最常用的方法，因为该技术允许以最高通量捕获所有已知的心细胞类型。细胞核分离需要酶解和机械解离，通常使用 Dounce 均质器来帮助释放细胞核。
在进行文库制备之前，可以通过过滤和FACS纯化细胞核，或者不太严格的方案包括过滤前的差速离心和密度梯度离心。如果只需要非心肌细胞，则新鲜样品的机械和酶组织解离可以恢复基质细胞和间质细胞。对于感兴趣的稀有细胞类型，可以通过细胞表面标记物的抗体标记，然后进行基于磁珠的富集或流式细胞术分选来实现特定群体的潜在富集。这些富集方法也可用于选择表达荧光蛋白的细胞，例如在谱系示踪实验中。
在分离和纯化步骤之后，捕获单细胞和细胞核，标记（通过条形码）并使用各种单细胞平台掺入文库制剂中：基于液滴的方法，例如10× Genomics的Chromium Controller，具有高通量;基于纳米孔的方法，例如：Takara Bio 的 ICELL8 仪器，它允许以中低通量选择各种细胞大小;微流体方法，如Fluidigm C1平台;基于多孔板的方案，如Smart-seq3xpress;以及基于多轮细胞分裂和池化的方法，例如 SPLiT-seq，它允许在不需要物理分离的情况下对单个细胞进行条形码编码。scRNA-seq，单细胞RNA测序;snRNA-seq，单核RNA测序。
见图二
计算分析工作流程。
图二
在对文库进行测序后，无论选择哪种采样程序，整个生物信息学流程基本相同。将读段与参考基因组比对后，使用全面的单细胞包（如 Scanpy 和 Seurat）进行质量控制、批次校正和数据集成。该过程中的一个关键步骤是细胞类型和状态的聚类和注释，这是在已知标记基因的表达和每个簇的转录特征的解释的基础上进行的。值得注意的是，基于深度学习的自动注释方法正在兴起。全面的注释有助于提高复杂下游分析的分辨率，例如：成分分析（在各种条件下组织中存在的各种细胞类型的比例）;不同疾病或治疗之间的差异表达分析;以及基于编码配体受体的基因在不同细胞类型和状态下的表达对细胞间通讯的推断。FC， 倍数变化;SMC，平滑肌细胞。
见图三
单细胞和单核分析揭示了成纤维细胞中以前未知的复杂性。
图三
成纤维细胞是体内平衡和疾病进展的关键，因为纤维化是对损伤反应的常见特征。单细胞和单核 RNA 测序为成纤维细胞在衰老心脏和不同疾病环境（如心肌梗死 （MI） 和扩张型心肌病 （DCM））中的作用提供了见解。使用单细胞和单核研究注释的成纤维细胞群列表如表2所示。COVID-19,2019 年冠状病毒病;TAC，横主动脉收缩。健康和患病心脏内皮细胞中基因标记物的物种特异性表达。
见图四
健康和患病心脏内皮细胞中基因标记物的物种特异性表达。
图四
a，人类心脏中主要血管结构的图示，包括心内膜，以及健康人类心脏中描述的关键内皮细胞亚群及其基因标记的总结。
b， 健康人和小鼠心脏内皮细胞中具有不同表达模式的基因。“无细胞状态特异性”表示该基因在多种细胞状态中富集，没有任何明确的特异性。
c， 在患病和健康心脏内皮细胞中差异表达的基因，包括扩张型心肌病（DCM）和缺血性心肌病（ICM）的人心脏，以及心肌梗死后（MI）后的小鼠心脏。TGFβ，转化生长因子-β。
见图五
将scRNA-seq和snRNA-seq数据与空间转录组学分析相结合，以定义细胞微环境及其动态细胞间信号网络。
图五
单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 和单核 RNA 测序 （snRNA-seq） 允许根据编码配体和受体的基因表达来定义细胞状态和预测细胞相互作用。但是，这些数据不提供有关蜂窝邻近性的信息。空间转录组学允许在代表微体转录组学数据的微瓦片上绘制组织切片内的基因表达图谱。通过使用 cell2location 和 Giotto 等计算工具将 scRNA-seq 和 snRNA-seq 数据映射到空间数据上，可以预测微瓦片和微解剖学生态位内细胞类型和状态的定位。定义的细胞生态位内的细胞接近性有助于推断最可能的细胞相互作用和鉴定的功能微环境。
02
研究结论
单细胞和单核组学技术为心脏细胞景观提供了宝贵的新见解，有助于更好地了解疾病机制，并为准确的风险分层和精准医疗提供更多工具。然而，新定义的细胞状态不仅需要彻底的验证，还需要合作和跨学科的努力，以标准化物种内和物种之间的定义和命名，这将有助于更准确的研究比较和疾病模型实验设计的优化。最后，迫切需要确保为新一代科学家和临床医生提供计算资源和培训，以改进对生物学的询问，并加速将这些变革性技术应用于心脏病的研究和治疗。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
