单核细胞是血液中的一种白细胞,它们是免疫系统的一部分,可以分化成巨噬细胞或树突细胞。在实验室中,单核细胞通常通过从外周血中分离获得。直接上干货,以下是一个详细的单核细胞分离和获取的操作步骤:
材料和试剂:
外周血样本
无菌磷酸盐缓冲液(PBS)
密度梯度介质,如Ficoll-Paque™
一次性无菌移液管
50 mL离心管
37°C水浴
离心机,能够进行低速和高速离心
试管架
无菌吸头
细胞培养基(如有需要)
操作步骤:
1 血液采集:外周血,通常使用含有EDTA的试管作为抗凝剂。
2 稀释血液:将血液样本按1:1的比例用无菌PBS稀释。
3 密度梯度离心:将稀释的血液轻轻覆盖在Ficoll-Paque™密度梯度介质上,通常每15 mL血液样本使用30 mL的Ficoll。在50 mL离心管中小心操作以避免混合。
4 分离单核细胞:将离心管放入离心机中,无制动慢速启动,以400g离心30分钟,无需打破温度,离心后保持在室温。
5 收集界面细胞:离心后,可见到分层现象,中间的白色层即为单核细胞层。使用无菌移液管轻轻吸取中间层的单核细胞。
6 洗涤细胞:将收集到的单核细胞转移到新的离心管中,并用PBS缓冲液洗涤两次,每次使用500 uL PBS,以400g离心10分钟。
7 去除红细胞:如果需要,可以通过裂解红细胞的方法去除残留的红细胞。这通常通过加入红细胞裂解缓冲液(0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA)来实现,随后再次离心以清除裂解的红细胞。
8 重悬细胞:将洗涤后的单核细胞重悬在适量的PBS中,计数细胞,并根据实验需要调整细胞浓度。
9 细胞培养(如需要):将单核细胞种植在细胞培养板或培养瓶中,加入适当的细胞培养基,并在37°C、5% CO2的条件下培养。
10 细胞表型确认:通过流式细胞术使用特定标记(如CD14)来确认单核细胞的纯度和表型。
注意事项:
1 所有操作应在无菌条件下进行,以避免细胞污染。
2 离心过程中要小心处理,避免细胞层的破坏。
3 操作应迅速且轻柔,以减少细胞的机械损伤。
4 如果细胞将用于流式细胞术分析,应避免使用对细胞有毒性的药物。
单核细胞的纯化:
如果需要更高纯度的单核细胞,可以采用阳性选择或阴性排除的方法进行进一步的纯化。以下是一些常用的单核细胞纯化技术:
1. 阳性磁珠分离法
材料和试剂:
磁珠分离试剂盒(例如Miltenyi Biotec的Monocyte Isolation Kit)
磁分离器(例如Miltenyi Biotec的MACS Separator)
细胞培养基
操作步骤:
1 细胞标记:使用试剂盒提供的抗人CD14微珠按照制造商的说明对单核细胞进行标记。
2 磁珠分离:将标记后的细胞通过MACS柱进行分离,阳性选择会保留标记有CD14阳性的单核细胞。
3 收集细胞:收集通过磁珠阳性选择的单核细胞,并进行洗涤。
4 细胞计数和培养:计数纯化后的单核细胞,并根据实验需要调整细胞浓度进行培养或分析。
2. 流式细胞术分离法
材料和试剂:
流式细胞分选仪
荧光标记的抗CD14抗体
细胞培养基
操作步骤:
1 细胞标记:用荧光标记的抗CD14抗体对单核细胞进行标记。
2 流式分选:使用流式细胞分选仪,根据CD14的荧光强度分离出CD14阳性的单核细胞。
3 收集细胞:收集分选后的单核细胞,并进行洗涤。
4 细胞培养:根据实验设计,将纯化的单核细胞进行培养或直接用于实验。
3. 免疫磁珠阴性排除法
材料和试剂:
免疫磁珠阴性排除试剂盒(例如StemCell Technologies的Mononuclear Cell Isolation II Kit)
磁分离器
操作步骤:
1 细胞标记:将单核细胞与试剂盒提供的免疫磁珠孵育,这些磁珠会与非单核细胞类型的细胞表面标记结合。
2 磁珠分离:通过磁分离器去除与磁珠结合的非单核细胞。
3 收集单核细胞:将未结合磁珠的单核细胞收集起来。
4 洗涤和计数:洗涤纯化的单核细胞,计数并根据实验需要调整细胞浓度。
注意事项:
1 在进行阳性选择或阴性排除时,要仔细遵循试剂盒的制造商指南。
2 流式细胞术分选前后,细胞应保持在适宜的温度和培养条件下,以减少细胞损伤和死亡。
3 磁珠分离和流式细胞术分选都应在无菌条件下进行,以避免细胞污染。
4 分选后的细胞应尽快进行实验,或根据需要进行适当的细胞培养。
材料和试剂:
外周血样本
无菌磷酸盐缓冲液(PBS)
密度梯度介质,如Ficoll-Paque™
一次性无菌移液管
50 mL离心管
37°C水浴
离心机,能够进行低速和高速离心
试管架
无菌吸头
细胞培养基(如有需要)
操作步骤:
1 血液采集:外周血,通常使用含有EDTA的试管作为抗凝剂。
2 稀释血液:将血液样本按1:1的比例用无菌PBS稀释。
3 密度梯度离心:将稀释的血液轻轻覆盖在Ficoll-Paque™密度梯度介质上,通常每15 mL血液样本使用30 mL的Ficoll。在50 mL离心管中小心操作以避免混合。
4 分离单核细胞:将离心管放入离心机中,无制动慢速启动,以400g离心30分钟,无需打破温度,离心后保持在室温。
5 收集界面细胞:离心后,可见到分层现象,中间的白色层即为单核细胞层。使用无菌移液管轻轻吸取中间层的单核细胞。
6 洗涤细胞:将收集到的单核细胞转移到新的离心管中,并用PBS缓冲液洗涤两次,每次使用500 uL PBS,以400g离心10分钟。
7 去除红细胞:如果需要,可以通过裂解红细胞的方法去除残留的红细胞。这通常通过加入红细胞裂解缓冲液(0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA)来实现,随后再次离心以清除裂解的红细胞。
8 重悬细胞:将洗涤后的单核细胞重悬在适量的PBS中,计数细胞,并根据实验需要调整细胞浓度。
9 细胞培养(如需要):将单核细胞种植在细胞培养板或培养瓶中,加入适当的细胞培养基,并在37°C、5% CO2的条件下培养。
10 细胞表型确认:通过流式细胞术使用特定标记(如CD14)来确认单核细胞的纯度和表型。
注意事项:
1 所有操作应在无菌条件下进行,以避免细胞污染。
2 离心过程中要小心处理,避免细胞层的破坏。
3 操作应迅速且轻柔,以减少细胞的机械损伤。
4 如果细胞将用于流式细胞术分析,应避免使用对细胞有毒性的药物。
单核细胞的纯化:
如果需要更高纯度的单核细胞,可以采用阳性选择或阴性排除的方法进行进一步的纯化。以下是一些常用的单核细胞纯化技术:
1. 阳性磁珠分离法
材料和试剂:
磁珠分离试剂盒(例如Miltenyi Biotec的Monocyte Isolation Kit)
磁分离器(例如Miltenyi Biotec的MACS Separator)
细胞培养基
操作步骤:
1 细胞标记:使用试剂盒提供的抗人CD14微珠按照制造商的说明对单核细胞进行标记。
2 磁珠分离:将标记后的细胞通过MACS柱进行分离,阳性选择会保留标记有CD14阳性的单核细胞。
3 收集细胞:收集通过磁珠阳性选择的单核细胞,并进行洗涤。
4 细胞计数和培养:计数纯化后的单核细胞,并根据实验需要调整细胞浓度进行培养或分析。
2. 流式细胞术分离法
材料和试剂:
流式细胞分选仪
荧光标记的抗CD14抗体
细胞培养基
操作步骤:
1 细胞标记:用荧光标记的抗CD14抗体对单核细胞进行标记。
2 流式分选:使用流式细胞分选仪,根据CD14的荧光强度分离出CD14阳性的单核细胞。
3 收集细胞:收集分选后的单核细胞,并进行洗涤。
4 细胞培养:根据实验设计,将纯化的单核细胞进行培养或直接用于实验。
3. 免疫磁珠阴性排除法
材料和试剂:
免疫磁珠阴性排除试剂盒(例如StemCell Technologies的Mononuclear Cell Isolation II Kit)
磁分离器
操作步骤:
1 细胞标记:将单核细胞与试剂盒提供的免疫磁珠孵育,这些磁珠会与非单核细胞类型的细胞表面标记结合。
2 磁珠分离:通过磁分离器去除与磁珠结合的非单核细胞。
3 收集单核细胞:将未结合磁珠的单核细胞收集起来。
4 洗涤和计数:洗涤纯化的单核细胞,计数并根据实验需要调整细胞浓度。
注意事项:
1 在进行阳性选择或阴性排除时,要仔细遵循试剂盒的制造商指南。
2 流式细胞术分选前后,细胞应保持在适宜的温度和培养条件下,以减少细胞损伤和死亡。
3 磁珠分离和流式细胞术分选都应在无菌条件下进行,以避免细胞污染。
4 分选后的细胞应尽快进行实验,或根据需要进行适当的细胞培养。